L’article présente le développement et la validation du PAX (Pet Allergy Xplorer), ce test sérologique innovant multiplex par macroarray qui détecte les IgE spécifiques aux allergènes chez les animaux.
Thierry Olivry1, Ana Mas Fontao2, Martina Aumayr3, Natalia Paulenka Ivanovova3,
Georg Mitterer3 and Christian Harwanegg3
[1] Nextmune AB, Riddargatan 19, SE-114-56 Stockholm, Sweden
[2] Nextmune Spain, Valentin Beato 24, 28037 Madrid, Spain
[3] MacroArray Diagnostics, Lemböckgasse 59, 1230 Vienna, Austria
La détection des sensibilisations IgE chez les chiens allergiques est généralement réalisée à l’aide d’extraits d’allergènes, mais ceux-ci sont difficiles à standardiser. Le PAX a été conçu en réponse à cette problématique, en utilisant à la fois des extraits d’allergènes et des composants moléculaires uniques pour identifier les sensibilisations. Nous vous proposons de découvrir une série de bulletins pour comprendre tous les détails de cet article.
Dans ce deuxième bulletin, nous vous expliquons la sélection des allergènes et le traitement de la cartouche.
2ème : La sélection des allergènes et le traitement de la cartouche
Sélection des allergènes
Le PAX pour chiens a été conçu de manière similaire à l’ALEX2 (Allergy Xplorer, MacroArrray Diagnostics, Vienne, Autriche), technologie développée pour l’allergologie humaine, en incluant environ un tiers d’extraits allergéniques et deux tiers de composants moléculaires. La sélection des allergènes a été basée sur ceux présents dans l’ALEX2, en partant de l’hypothèse que les protéines allergéniques chez l’humain pourraient aussi l’être chez les animaux. Certaines protéines, pour être immunogènes et reconnues par l’IgE, doivent posséder des caractéristiques spécifiques, comme par exemple une structure tridimensionnelle unique ou des propriétés enzymatiques particulières [21]. Nous avons exclu les allergènes non pertinents pour les chiens, et ajouté ceux qui sensibilisent spécifiquement les chiens, comme l’extrait de Dermatophagoides farinae (Der f) et ses composants Der f 15 et Der f 18.
La plupart des composants sont des protéines recombinantes produites dans des bactéries Escherichia coli ou la levure Pichia pastoris, tandis que les autres sont des allergènes natifs purifiés.
Tous les extraits et composants moléculaires ont été couplés à des nanobilles de latex avant d’être déposés par machine sur une membrane de nitrocellulose, qui a ensuite été découpée et intégrée dans une petite cartouche de 5,5 cm par 1,5 cm (Figure 1), en suivant le même procédé automatisé que pour l’ALEX2.
Figure 1. Représentation d’une cartouche ALEX2/PAX, permettant le test multiplex simultané de jusqu’à 300 allergènes et leurs contrôles.
Photo MacroArray Diagnostics, Vienne, Autriche.
Tous les allergènes de la cartouche ont été standardisés selon leur activité biologique, vérifiée à divers points de contrôle. La méthode de couplage allergènes-nanobilles et la concentration en allergène ont été validées, puis des tests supplémentaires avec des sérums positifs ont confirmé la précision du marquage sur la membrane.
La version 22.2 du PAX pour chiens, utilisée en 2022 et 2023, comprend 247 spots d’allergènes (75 extraits individuels, deux mélanges de deux extraits, 169 composants individuels et un mélange de deux composants), dont 132 dédiés aux aéroallergènes environnementaux (53,4 %). Elle inclut également 13 spots pour les venins d’Hyménoptères (5 %) et 98 pour les allergènes alimentaires (39,7 %) [ndlr : allergènes alimentaires non disponibles actuellement sur les tests en France]. Deux détecteurs de CCD et leurs contrôles non-CCD complètent cette configuration.
Traitement de la cartouche
Des travaux de mises au point ont été réalisés et ont permis de valider le processus de traitement de la cartouche. Les sérums canins sont traités sur un automate MAX45K (MacroArray Diagnostics), capable de tester jusqu’à 50 échantillons en 4 heures. Les sérums dilués dans un mélange contenant un bloqueur de CCD sont incubés sur les cartouches pendant 1,5 heure, puis rincés trois fois avec la solution de lavage PAX. Pour détecter les IgE spécifiques aux allergènes, le test utilise des anticorps monoclonaux 5.91 couplés à la phosphatase alcaline, qui reconnaissent uniquement un épitope du domaine Cε2 de l’IgE canine, sans interférer avec les IgG, IgM ou IgA [27]. Après une incubation de 20 minutes, cinq rinçages sont effectués, suivis d’une réaction colorimétrique stoppée après 9 minutes, et les résultats sont lus par un capteur CMOS. Les résultats obtenus sont exprimés en ng/mL d’IgE spécifique à l’allergène grâce à une courbe d’étalonnage d’IgE canins présents sur la cartouche.
Discussion
Le PAX, comme son équivalent humain ALEX2, comprend environ un tiers d’extraits allergéniques et deux tiers de composants moléculaires spécifiques. La version discutée dans cet article contient 247 points allergéniques. Actuellement, le PAX est le test sérologique le plus complet disponible pour détecter les sensibilités IgE chez les chiens.
Alors qu’il existe une compréhension avancée des allergènes moléculaires chez les humains allergiques, les rapports sur les allergènes identifiés par IgE chez les chiens restent rares et concernent surtout des allergènes alimentaires. Ainsi, notre sélection d’allergènes moléculaires pour le PAX repose sur l’hypothèse que les protéines provoquant des réponses IgE chez les humains pourraient susciter des réactions similaires chez les animaux, hypothèse confirmée par les résultats montrant que tous les composants inclus sont reconnus par les IgE chez plusieurs chiens. L’éventail d’allergènes testé par le PAX contribue à enrichir l’allergome canin, et des recherches sont en cours pour identifier d’autres allergènes moléculaires à intégrer dans les prochaines versions du test.
Découvrez la suite de l’analyse de cette publication dans notre prochain article !
Et pour lire l’article original dans son intégralité, cliquez ici : https://www.mdpi.com/2306-7381/11/10/482
Pour toute question, contact-france@nextmune.com
[21]Thouvenot, B.; Roitel, O.; Tomasina, J.; Hilselberger, B.; Richard, C.; Jacquenet, S.; Codreanu-Morel, F.; Morisset, M.; Kanny, G.; Beaudouin, E.; et al. Transcriptional frameshifts contribute to protein allergenicity. J. Clin. Investig. 2020, 130, 5477–5492.[CrossRef] [PubMed]
[27] Hammerberg, B.; Bevier, D.; DeBoer, D.J.; Olivry, T.; Orton, S.M.; Gebhard, D.; Vaden, S.L. Auto IgG anti-IgE and IgG x IgE immune complex presence and effects on ELISA-based quantitation of IgE in canine atopic dermatitis, demodectic acariasis and helminthiasis. Vet. Immunol. Immunopathol. 1997, 60, 33–46. [CrossRef]
