Diagnostic hématologique
Introduction
Le diagnostic hématologique a pour but de mettre en évidence dans le sang, et
par extension, le système lymphatique, des éléments parasitaires.
Il s'agit notamment de certains protozoaires: Babesia canis, Hepatozoon
canis et Leishmania infantum; et de microfilaires sanguicoles: Dirofilaria
immitis, Dirofilaria repens et Dipetalonema.
En dermatologie, ce sont les microfilaires qui seront recherchées.
La principale technique reste l'étalement sanguin ("frottis" suivi d'une
coloration de May Grünwald Giemsa M.G.G.). Il permet l'identification des babésies
et d'Hepatozoon, mais aussi d'autres agents pathogènes comme les Ehrlichia,
ou dans les milieux tropicaux les trypanosomes.
Une goutte de sang
(généralement périphérique) est déposée sur une lame dégraissée à l'alcool-ether.
La goutte est étalée sur la lame au moyen d'une lamelle ou d'une lame rodée
(non pas en la poussant mais en la tirant). La goutte doit être complétement
étalée avant la fin de la lame.
Les parasites sont
plus fréquents en bordure et en queue de frottis, partie la plus riche en leucocytes.
La coloration la plus
employée est le May Grünwald Giemsa (M.G.G.).
May Grünwald : 10 gouttes pendant 3 min.
Eau distillée : rajout
de l'eau sans rejeter le M.G. 1 min, verser l'ensemble
Giemsa (3 gouttes de
Giemsa pur pour 2 ml d'eau distillée) : recouvrir la lame 10 à 20 mn.
Chasser le colorant
avec de l'eau, délicatement
Laisser sécher
Observer la lame au
microscope à immersion : Obj. X100 à immersion.
Les babésies, comme
les Hepatozoon, peuvent être facilement mis en évidence à l'aide de coloration
sanguine dite rapide (Par exemple: Hémacolor).
Certaines techniques peuvent permettre d'enrichir le prélèvement en babésies :
Technique de la goutte épaisse : goutte de sang déposée sur 1 cm², séchée,
immergée dans l'eau distillée, puis colorée par MGG.
Technique de micro-hématocrite
: récupération de la zone leucocytaire sur microtubes après centrifugation,
puis coloration.
Identification des protozoaires sanguins
Babesia canis : protozoaire
Apicomplexa parasitant exclusivement les hématies. Plusieurs formes possibles
dans les globules rouges. Observation après coloration d'un étalement sanguin
au May Grünwald Giemsa ou coloration rapide.
Forme anaplasmoïde (rare): trophozoïte en dégénérescence de 1 à 2 µm,
ponctiforme d'où l'analogie aux anaplasmes, au cytoplasme vacuolaire, très réduit,
ne prenant pas le colorant, avec un noyau marginal (violacé).
Forme ronde
(courante) : trophozoïte ou gamonte infectant pour les tiques, de 3 à 4 µm de
diamètre , au cytoplasme vacuolaire, non coloré, et à chromatine marginale.
Forme bigéminée
(la plus classique) : Généralement par paire, parfois par 4, 8 ou plus, issues
de divisions binaires. Aspect piriforme ("en poire"), caractéristique,
allongée, mesurant 4-5 µm, les extrémités effilées d'un même côté.
Babesia canis est une babésie de grande forme, par opposition à d'autres espèces comme Babesia gibsoni ( forme ronde de 1 à 2,5 µm ; forme bigéminée de 2,5 µm). Cytoplasme "blanc" du fait de la vacuole, chromatine violacée rejetée en périphérie.
Hepatozoon canis : Protozoaire Apicomplexa proche taxonomiquement
des coccidies intestinales. Schizogonies dans les cellules blanches de la rate
et de la moelle osseuse. Apparition des gamontes dans les polynucléaires circulants.
6 x 3 µm pour les gamontes, ovalaires et "blancs", en forme d' "obus",
dans le cytoplasme des polynucléaires, en général neutrophiles. Noyau des polynucléaires
repoussé en périphérie, cytoplasme occupé par ce protozoaire ayant l'aspect
caractéristique d'un ovale blanc ne prenant aucun colorant.
Mise en évidence des leishmanies
Les leishmanies sont recherchées dans les populations macrophagiques à partir
de divers prélèvements, mais jamais dans du sang circulant, car elles sont rarement
observées dans les monocytes.
La ponction de moelle
osseuse, la ponction ganglionnaire et le calque ou le copeau cutané sont les
techniques à choisir.
Le suc ganglionnaire
récolté est étalé sur une lame puis coloré par MGG. La ponction des noeuds lymphatiques
est peu douloureuse, facile à réaliser et sans risque pour l'animal. Il suffit
de récupérer une goutte de lymphe et de cellules à l'aide d'une seringue et
d'une aiguille de diamètre suffisant (1,2 mm).
Leishmania infantum: amastigotes
présents au sein d'une vacuole parasitophore dans les macrophages parasités.
Ils sont ovalaires et mesurent 3-4 x 2 µm. Ils renferment un volumineux noyau
et un élément en forme de bâton, le kinétoplaste. Ces deux éléments sont généralement
perpendiculaires l'un par rapport à l'autre.
Des leishmanies peuvent se voir en position extracellulaire lorsque des macrophages
sont altérés par les techniques de prélèvements ou de coloration, ou lors de
leur lyse et avant qu'elles n'en infectent un autre. Les macrophages infectés
sont hypertrophiés et prennent souvent un aspect muriforme, leur noyau est repoussé
vers la périphérie.
2- Mise en évidence des microfilaires
Les microfialires pouvant être identifiées chez
le chien appartiennent à 5 espèces :
Dirofilaria immitis
Dirofilaria repens
Dipetalonema (Acanthocheilonema)
reconditum
Dipetalonema (Acanthocheilonema)
dracunculoides
Dipetalonema (Cercopithifilaria)
grassii
Ces filaires peuvent toutes être retrouvées dans
le sang circulant. Les techniques de mise en évidence comprennent l'examen direct
d'une goutte de sang entre lame et lamelle, ainsi que l'étalement sanguin ou
la goutte épaisse, colorés par M.G.G., mais avec une sensibilité médiocre.
Des méthodes d'enrichissement ont donc été développées : il s'agit de la centrifugation
ou méthode de Knott, et de la filtration sur membrane à micropores.
Le problème de la différenciation morphologique des microfilaires entre elles
peut être résolu par une coloration histochimique spécifique, mettant en évidence
des zones d'activité phosphatasique acide.
Examen direct d'une goutte de sang frais
Cette méthode très simple manque de sensibilité. L'échantillon doit impérativement être examiné avant coagulation, ou bien prélevé sur anticoagulant.
1. Déposer sur une lame une goutte de sang après
ponction des capillaires cutanés.
2. L'observer immédiatement au microscope entre lame et lamelle. Les microfilaires
sont repérées au milieu des hématies grâce à leurs mouvements ondulatoires.
Méthode très simple utilisable en diagnostic de routine. Elle manque de sensibilité du fait de l'absence de concentration. Néanmoins, elle respecte bien les structures des parasites.
1. Déposer sur une lame une petite goutte de sang
après ponction des capillaires cutanés.
2. Etaler la goutte à l'aide d'une lamelle, le plus finement possible et sécher.
3. Effectuer une coloration (exemple : May-Grünwald-Giemsa)
4. Examiner au microscope la queue du frottis, plus riche en parasites.
Méthode très simple mais dont les résultats ne sont observables que 24 heures après. Elle permet une certaine concentration des parasites.
1. Prélever une grosse goutte de sang par ponction
des capillaires cutanés.
2. Déposer la goutte sur une lame en lui imprimant des mouvements circulaires
à l'aide de l'extrémité de la pipette ou d'un coin de lamelle. Ne pas étaler.
3. Laisser sécher 12 heures à l'abri de la poussière.
4. Déposer une goutte d'eau distillée et laisser agir 20 minutes (hémolyse).
Sécher.
5. Effectuer une coloration (May-Grünwald-Giemsa) puis observer au microscope.
Examen de sang veineux (après enrichissement)
Sédimentation=technique de KNOTT modifiée
Cette méthode est assez longue à réaliser. Elle permet néanmoins d'obtenir de bonnes préparations microscopiques.
1. Prélever du sang par ponction veineuse.
2. Dans un tube à essai, mélanger 1 ml de sang à 9 ml de Teepol 10% (hémolyse).
3. Laisser reposer 12 à 24 heures ou centrifuger 10 min. à 2000 t/min.
4. Prélever une grosse goutte du culot de sédimentation (technique de la goutte
épaisse).
5. Déposer la goutte sur une lame en lui imprimant des mouvements circulaires
à l'aide de l'extrémité de la pipette. Ne pas étaler.
6. Laisser sécher 12 heures à l'abri de la poussière.
7. Déposer sur la goutte séchée de l'eau distillée et laisser agir 20 minutes
(hémolyse). Sécher.
8. Effectuer une coloration (May-Grünwald-Giemsa) puis observer au microscope.
Filtration sur membrane (Kits du commerce) Ex : Difil-test kit (photo)
Cette méthode est de loin la plus usitée. Elle allie la fiabilité, la rapidité et la facilité de sa mise en œuvre.
1. Prélever 1 ml de sang.
2. Aspirer, dans la même seringue, 9 ml d'une solution hémolysante (10% Teepol,
90% sérum physiologique ; ou formol à 2%). Agiter.
3. Adapter le porte-filtre, muni d'une nouvelle membrane, sur l'embout de la
seringue.
4. Chasser le contenu de la seringue au travers du filtre.
5. Rincer la seringue à l'eau distillée et en chasser le liquide au travers
du filtre.
6. Démonter le filtre, récupérer la membrane et la déposer sur une lamelle.
7. Verser deux gouttes de colorant, recouvrir d'une lamelle. A l'aide d'une
gaze, essuyer l'excès de colorant sur les bords de la lamelle.
8. Observer au microscope.